基因芯片技术是什么？一文读懂基因芯片！(2)

由于芯片种类较多，其制备方法也不尽相同，传统的制备方法基本可分为两类：一类是原位合成，另一类是直接点样。原位合成是用于寡氨基酸，直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸甚至mRNA。原位合成主要有光刻法和压电打印法两种途径。

1. 原味光刻合成

其利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置确定、高度多样化的化合物集合。合成的第一步是利用光照射，使固体表面上的羟基脱保护，然后固体表面与光敏保护基保护的、亚磷酰胺活化的碱基单体接触，使一个核苷酸单体连接上去，合成只在那些脱去保护基的地方发生，这个过程反复进行直至合成完毕。这个方法最大的优点就是在一个较小的区域，可制造大量不同的探针。但是这种制备方法需要预选设计，制造一系列掩盖物，造价较高，制造过程中采用光脱保护方法，掩盖物孔径较小时会发生光衍射现象，制约了探针密度的进一步提高。

2. 原味打印合成

此原理与油墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基的液体而不是碳粉，喷印头可在整个芯片上移动，并根据芯片上不同位点探针序列的需要，将特定的碱基喷印在芯片上的特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。

3. 分子印章原位合成

其合成原理类似于传统的印章，其表面按照阵列合成的要求制作成凹凸不平的平面，依此将不同的核酸或多肽合成试剂按印到芯片片基特定的位点，然后进行合成反应。

4. 点样法

与原位合成法比较，点样法较为简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点样于经原位特殊处理的玻璃片或其他材料上。即其样品可以事先纯化，交联的方式多样；而且可以通过调节探针的浓度使不同碱基组成的探针杂交信号一致，研究者可以方便地设计、制备符合自己需要的基因芯片。但是芯片的这种制备过程中，样品浪费较为严重，对寡核苷酸的化学修饰也会增加合成成本，而且芯片制备前需要储存大量样品。

新的制备技术

1. 微电子芯片

利用微电子工业常用的光刻技术，芯片被设计构建在硅/二氧化硅等基底材料上，如图2所示，经热氧化，制成1mm×1mm的阵列，每个阵列含有多个微电极，在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。电子芯片最大特点是杂交速度快，可大大缩短分析时间，但制备复杂、成本高。

2. 三维生物芯片

这种芯片技术主要是利用官能团化的聚丙酰氨凝胶块作为基质来固定寡氨基酸。通常的制备方法是将有活性基团的物质或丙烯酰胺衍生物与丙烯酰胺单体在玻璃板上聚合，机械切割出三维凝胶微块，使每块玻璃片上有10 000个微小的聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条可用于靶DNA、RNA或蛋白质的分析，光刻或激光蒸发除去凝胶块之间的凝胶，再将带有活性基团（氨基、醛基等）的DNA点，加到凝胶上进行交联，再将DNA样品转移到凝胶块上。

3. 流过式芯片

即在芯片片基上制成格栅状微通道，设计及合成特定的寡氨基酸探针，结合于微通道内芯片特定区域。从待检测样品中分离DNA或RNA，并对其进行荧光标记，然后该样品流过芯片，固定的寡氨基酸探针捕获与之相互补的核酸，再用信号检测系统分析结果。其特点是敏感度高、速度快、价格较低。

当前主要几种基因芯片技术

光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列

开发并掌握这一技术的是Affymetrix公司，Affymetrix采用了照相平板印刷技术技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片，生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的基因芯片可以达到1×106/cm2的微探针排列密度，能够在一片1厘米多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。

原位合成法主要为光引导聚合技术（Light-directed synthesis），它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（photolithography）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽列阵提供了一条快捷的途径。

Affymetrix公司已有诊断用基因芯片成品上市，根据用途可以分为三大类，分别为基因表达芯片、基因多态性分析芯片和疾病诊断芯片，基因表达分析芯片和基因多态性分析芯片主要用于研究机构和生物制药公司，可以用来寻找新基因、基因测序、疾病基因研究、基因制药研究、新药筛选等许多领域，Affymetrix公司主要生产通用寡聚核苷酸芯片；疾病诊断芯片则主要用于医学临床诊断，包括各种遗传病和肿瘤等，目前Affymetrix公司生产三种商品化诊断芯片，分别为p53基因突变诊断芯片、艾滋病病毒基因基因突变诊断芯片和细胞色素P450基因突变诊断芯片。

微电子芯片

Nanogen开发了多位点电控阵列并含独立可寻址检测区域的微电子基因芯片，其基质全部以硅、锗与基础的半导体材料，在其上构建25-400个微铂电极位点，各位点可由计算机独立或组合控制。无论在芯片制造或成品芯片检测，均可通过相似微电极的电场变化来使核酸结合，引入“电子严谨度”参数使芯片检测通过靶、探针序列特征和使用者要求来控制杂交过程中的严格性。这种微电子基因芯片具有以下优点：

1．电场定位过程能选择性地转运带电荷DNA分子，通过每个微电极位点的电场正负、强弱变化，能准确有效地随意调控芯片表面的核酸，既可将核酸结合在微电极位点上，也可以使核酸转运出来。